二面法工艺提取蛋白响应活性优化氧化研究及抗川芎

1.2.7.2 超氧阴离子自由基清除能力的面法测定

取不同浓度的LCP溶液液各0.04mL，按试剂盒加入反应试剂一0.26mL、优化氧化研究试剂二0.32mL、川芎试剂三0.04mL、蛋白试剂四0.06mL，工艺混匀，及抗即为测定组。活性取等体积蒸馏水，面法同法制备对照组。优化氧化研究依上述方法，川芎不加试剂三，蛋白加蒸馏水补足体积，工艺混匀，及抗即为空白组。活性于37℃反应10min，面法转移至玻璃比色皿中，蒸馏水调零，570nm读取各组吸光度值A，平行测定3次，以V_C为阳性对照组，如下公式（4）计算清除率。

式中：A₁：对照组吸光度值，A₂：测定组吸光度值，A₃：空白组吸光度值。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力的测定

分别吸取1.47mg/mL的LCP溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加80%甲醇补足至1mL，备用。取上述不同浓度的LCP溶液0.4mL，按试剂盒加入0.6mL工作液制，混匀，即得测定组。取0.4mL不同浓度的LCP溶液与0.6mL80%甲醇溶液为对照组。取0.4mL80%甲醇溶液与0.6mL工作液，充分混匀，即得空白组。室温避光静置30min使之充分反应，无水乙醇调零，于517nm读取吸光度值A，每个浓度的样品重复测定3次，取均值，以VC为阳性对照组，按公式（5）计算清除率。

式中：A₁：测定组吸光度值，A₂：对照组吸光度值，A₃：空白组吸光度值。

1.3 数据处理

实验结果用平均值±标准差表示，采用Designexpert8.0.6进行响应面实验数据优化，用SPSS26.0软件进行方差分析，以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

实验结果见图1（a），LCP得率先随pH的增大而增大。推测在一定范围内，增大pH，因形成羧基离子和去质子胺，蛋白质分子中含有更高的负电荷排斥力，使蛋白质和水分子之间的相互作用增加，而增加LCP的溶解度；亦可能是因偏离LCP的等电点，而增加LCP的溶解度，最终使LCP得率增大。pH6时LCP的得率为（2.23%±0.05%），而后LCP得率随pH增大而减小。推测较高pH水平下提取样品时，因增加淀粉及其他杂质物质的溶出，而稀释LCP的浓度。且在碱性条件下，酚类化合物易从药材中释放并与蛋白质共价结合而后快速氧化，导致提取物的颜色呈褐色。经方差分析，P=0.002＜0.01，表明pH对LCP得率的影响有极显著性。综合考虑，选取提取液pH5～7进行响应面法优化试验。

从图1（b）可发现，蛋白质得率因料液比的不同而差异明显。料液比在1:5～1:15（g/mL）范围内，蛋白质得率逐渐增加，这是由于随着料液比的增大，溶液中分子扩散和碰撞速率加快，促进蛋白质分子的溶解。当料液比在1:15～1:25（g/mL）范围内，得率逐渐下降，推测是由于料液比增大而致蛋白质分子分散性加大，不易酸沉获得蛋白质，同时一些可溶性杂质溶解阻碍蛋白质溶出，且不利于获得纯度较好的蛋白质。经方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比对LCP得率的影响具有显著性。综合考虑，选取料液比1:10～1:20（g/mL）进行响应面法优化试验。

从图1（b）可发现，蛋白质得率因料液比的不同而差异明显。料液比在1:5～1:15（g/mL）范围内，蛋白质得率逐渐增加，这是由于随着料液比的增大，溶液中分子扩散和碰撞速率加快，促进蛋白质分子的溶解。当料液比在1:15～1:25（g/mL）范围内，得率逐渐下降，推测是由于料液比增大而致蛋白质分子分散性加大，不易酸沉获得蛋白质，同时一些可溶性杂质溶解阻碍蛋白质溶出，且不利于获得纯度较好的蛋白质。经方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比对LCP得率的影响具有显著性。综合考虑，选取料液比1:10～1:20（g/mL）进行响应面法优化试验。

在特定条件下，蛋白质浸出需要一定时间达到平衡状态；时间较短，分子扩散效率一定，蛋白质溶出量有限；延长浸提时间蛋白质得率呈下降趋势，可能是由于蛋白质长时间在碱性环境中会发生轻微水解和变性，而且时间延长也会增加非蛋白物质浸出，影响蛋白质进一步沉淀和蛋白制品的纯度，且与同类豆类如豌豆、大豆和蚕豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖与蛋白质的相互作用可能导致川芎中提取蛋白的价值降低。经方差分析，P=0.023＜0.05，表明提取时间对LCP得率的影响具有显著性。综合考虑，选取提取时间1～2h进行响应面法优化试验。

2.2 响应面分析LCP提取工艺试验结果

2.2.1 响应面法优化实验设计及结果

每组样品平行测定3次，取平均值，并进行数据散点图和统计分析。DesignExpert8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。结果如表3所示，得拟合方程为

y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C−0.055AB+0.078AC+0.13BC−0.47A²−0.34B²−0.54C²。

2.2.2 方差分析结果

如表4所示，模型F=40.23，Pr＞F＜0.01，说明此回归模型是极显著的。方程失拟项F=0.89，Pr＞F＞0.05，失拟项相对于纯误差影响不显著，说明回归模型与实测值拟合度较好，适用性高，可以使用该回归方程代替试验真实点分析试验结果。各因素的影响大小为：提取时间＜提取溶剂pH＜料液比。通过F检验来判定，概率P（F＞Fα）的值越小，则相应变量的显著程度越高，对试验指标的影响越大，P_A、P_B、P_C均小于0.01，说明提取时间、料液比、提取溶剂pH对LCP得率的影响极显著。R²=0.9810，R²_Adj=0.9566，表示所建立的模型能够很好地反映独立变量和响应变量之间的关系。

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